핵산 염색의 특성과 염색법

핵산의 기본단위인 뉴클레오타이드를 구성하는 각각의 성분을 조직화학적 방법으로 증명할 수 있다. 인산기는 호염기성을 나타내기 때문에 핵산의 일반염색으로 염기성 염료가 널리 사용된다는 것은 잘 알려져 있다. 그러나 이 경우는 핵산 이외의 다른 성분들도 염기성 염료와 결합하므로 특이적인 염색이라고는 볼 수 없다. 염기성 염료 중 메틸그린은 DNA에 대해 특별한 친화력을 가지고 있어서 MG-P 염색에 사용되고 있다. 푸린과 피리미딘 염기를 염색하여 DNA를 증명하는 방법은 1947년 다니엘리가 테트라졸륨 반응을 이용하여 개발하였으나 핵단백질 염색의 비특이적인 것으로 밝혀져 현재는 거의 사용되지 않고 있다. DNA의 오탄당은 산 가수분해 후 알데하이드-시프반응에 의해 동정이 가능하며, 이 원리를 이용한 포일겐 반응은 DNA 증명법 중 매우 정밀하고 특이적인 염색법의 하나로 확고한 위치를 차지하고 있다. RNA는 피로인에 잘 염색되는 성질이 있기 때문에 이것을 이용하는 MG-P 염색은 부분적으로 기술상 어려움이 있음에도 불구하고 여전히 RNA와 DNA의 표준 염색법으로 가장 많이 사용하고 있다. MG-P 염색에 RNase 소화법이나 화학적 추출법을 함께하면 훨씬 특이도를 높일 수 있다. 핵소체는 호염기성 또는 호산성의 양 성질을 함께 지니고 있다. 이 중 호염기성은 핵산 함량의 상대적 비율이 높기 때문이고, 호산성은 핵산에 비해 단백질 함량이 상대적으로 높기 때문으로 파악하고 있다. 다시 말하면 산성 염료와 염기성 염료에 대한 핵소체의 염색반응은 핵산과 단백질의 상대 비율의 차이에 따라 달라지는 것을 의미하며, 이 반응은 고정액과 염색액의 pH에도 영향을 받는다. 핵소체는 포일겐 반응에 음성, MG-P 염색에는 호피로 넌 성을 보이며, 성염색질체 염색에 음성, 아크리딘오렌지 형광염색에서 적색 형광을 나타낸다. 포일겐 반응을 알아보자. 핵산을 1N HCl로 60도에서 가수분해하려면 DNA의 데옥시리보스와 결합하여 있던 퓨린염기가 분리되면서 알데하이드가 형성된다. 이 알데하이드에 시프시약이 반응하여 원래의 염기성 푹신과는 약간 다른 장파장의 포일 겐 색소 복합체를 만드는 반응이다. 이 반응에서 리보스와 결합한 퓨린염기는 가수분해가 일어나지 않기 때문에 RNA는 염색되지 않아 DNA에 특이하게 적자색으로 염색된다. 산 가수분해에 드는 적정 시간은 고정에 사용한 고정액의 종류에 따라 다르게 조절해야 한다. 만일 가수분해 시간을 적정 시간보다 짧게 두거나 반대로 너무 오래 두면 반응이 제대로 나타나지 않거나 알데하이드가 더 분해되어 반응이 일어나지 않게 된다. 특히, 보잉 액은 핵산을 과산화시키는 경향이 있으므로 사용을 금한다. MG-P 염색을 알아보자. 1901년 파펜하임은 염기성 염료인 메틸그린과 피로닌 혼합액을 사용하여 염색질이 녹색, 염기 호선 봉입체가 적색으로 염색됨을 보고하였다. 이 방법은 후에 운 나에 의해 페놀이 사용되면서 운이나-파펜하임 염색으로 널리 알려지게 되었다. 이 두 염기성 염료에 대한 DNA와 RNA 사이의 염색성 차이는 현재까지도 화학적으로 명확히 밝혀져 있진 않지만 두 가지 이론이 상당한 공신력을 얻고 있다. 첫째는 염색 이론에서 지적한 바와 같이 염기성 염료들은 염색액의 pH의 차이에 따라 각기 다른 성분들과 결합하는 성질을 가진다는 이론이다. 두 종류의 서로 다른 염색 반응능을 가진 염기성 염료를 대상으로 각 염료가 잘 염색되는 PH의 중간 범위로 만들어 반응시켜 보면 각기 다른 산성 물질에 다르게 염색됨을 알 수 있다. 이러한 현상은 메틸그린과 피로인을 혼합하여 pH를 변화시켜 보면 쉽게 확인할 수 있다. 즉 염색액을 낮은 pH에서 반응시키면 피로인에만 염색되고, 높은 pH에서 반응시키면 메틸그린이 훨씬 두드러지게 강한 염색성을 나타내며, 이 두 pH의 중간인 pH4.8에서는 서로 다른 성분에 각각 염색된다. 이런 의미에서 보면 초기에 운 나가 사용한 페놀 처리 방법은 염색액의 pH를 약간 낮춤으로써 이러한 차이를 유발하는 데 영향을 미쳤을 것으로 생각할 수 있다. 둘째는 커니즈에 의해 제시된 이론으로 DNA와 RNA 사이의 염색성 차이는 핵산의 중합도 차이에 기인한다는 것이다. 즉, 고중합체인 DNA는 메틸그린과 결합하고 저 중합체인 RNA는 피로인과 결합이 된다고 보는 견해이다. 이 같은 이론적 배경은 DNA를 산, 자외선, 방사선, 고정액 등으로 처리하여 해외 축구시킬 경우, 메틸그린의 결합 능이 상실되지만, 피로인의 결합 능은 증가한다는 실험 결과로부터 나오게 되었다. MG-P 염색은 특히 형질세포의 증명에 매우 유용하다. 형질세포의 핵 염색질은 핵막에 인접하여 응축되고 규칙적으로 배열되어 청록색의 마차 바퀴 모양으로 나타나며, RNA가 존재하는 핵소체와 리보솜이 붙어 있는 과립 형질 내세 망은 적색으로 염색된다. 길로 사이아닌-크롬 일룸 염색을 알아보자. 이 방법은 MG-P 염색에 비해 사용하는 고정액의 제한이 적으며 염색 과정이 간단하고 감별이 필요치 않은 것이 장점이다. 특이도가 좋지 않지만 소화법이나 화학적 추출법을 병용하면 특이도가 높아진다. 거로 사이아닌은 산성 pH에서 핵산의 인산기와 결합한다. 아크리딘 오렌지 염색에 대해 알아보자. 형광염료인 아크리딘 오렌지를 사용하여 신선한 조직절편 또는 세포 도말표본에서 DNA를 증명하는 방법이다. 아크리딘은 이온결합이나 다른 결합력에 의해 세포 내의 핵산과 결합한다. 염색 결과는 형광현미경을 사용하여 검경한다. DNA는 녹색 형광, RNA는 적색 형광을 나타낸다. 자궁경부 도말표본에서 암세포를 동정하는 방법의 하나로 널리 사용되고 있다. 영구표본은 얻을 수 없다.