면역조직화학 면역글로불린

항체는 면역글로불린이라 부르는 한 무리의 단백질에 속한다. 면역글로불린은 혈장 또는 혈청 내에 존재하는 양에 따라 IgG, IgA, IgM, IgD, 그리고 IgE의 주요 다섯 클래스가 존재한다. 각 면역글로불린은 두 개의 동일한 무거운 사슬과 가벼운 사슬을 가지고 있다. H 사슬은 항원성과 구조적 성질이 달라 그 분자의 클래스와 서브 클래스를 결정한다. 두 개의 L 사슬은 카피와 람다 형으로 구분한다. 카피와 람다 사슬의 분포는 동물 종에 따라 다를 뿐만 아니라 모든 iG 클래스 및 서브 클래스에서도 다르다. L과 H사를 사이와 H와 H사를 사이는 s-s 가교의 공유결합에 의해 연결되어 있다. 이 면역글로불린 분자는 3차 구조를 갖추면서 더욱 안정적인 형태를 갖는다. 면역글로불린의 다섯 클래스 중 IgG와 IgM은 면역조직화학에서 지금까지 가장 흔히 사용되고 있는 항체이므로 아래에서 좀 더 자세히 다루었다. 또한 여기서 다루는 IgG의 서브 클래스 IgG 1을 대상으로 한 것이다. 과 면역된 동물에서 유래한 항체는 다가항원 위에 있는 항원결정기에 대한 인식이 다를 뿐만 아니라 같은 항원결정기에 대해서도 친화성이 다르다. 친화도란 용어는 내인성 친화도와 기능성 친화도를 기술하는 데 사용되어 왔다. 항체의 내인성 친화도는 HV 영역에 있으며, 특이도를 결정하는 같은 아미노산의 서열에 의해 결정된다. 그러나 특이도가 클수록 반드시 친화도가 더 강하다고 말할 수는 없다. 항체의 파라토프와 항원의 에피토프 사이의 내인성 친화도에 미치는 주요 기여 인자는 이온 사이의 반응, 수소결합 및 반댄 발 그 힘이다. 소수성은 면역복합체 형성에 안정적 효과를 주며 면역복합체의 침전을 유도하는 것으로 알려져 있다. 항체와 항원 사이에는 공유결합이 생기지 않는다. 항체와 그에 대응하는 항원결정기 사이 결합의 관계 항수가 항체의 친화성 수치이다. 이에 대해, 항체의 결합력이란 용어는 기능적 친화성을 기술하는 의미와 같은 동의어로 사용되어 왔으나, 항체와 항원 사이에 결합력을 표현하는 의미로도 사용되고 있다. 또한 결합력이란 용어는 흔히 다클론항체에 출현하는 모든 내인성 친화도를 종합적으로 기술하는 데도 사용되고 있다. 항원-항체 반응은 가역적이기 때문에 조직 위에 형성된 단순한 면역복합체는 염색의 수세 과정에서 떨어져 나가기도 한다. 이 해리 정도는 항체에 따라 다르다. 일반적으로 염 농도와 온도가 낮을수록 이미 형성되어 있던 면역복합체의 해리로 인해 발생할 수 있는 염색성의 저하 가능성이 감소한다. 다클론항체의 경우 특정 항원의 몇 종류의 항원결정기에 대해 다소 친화성이 다른 항체들이 포함되어 있기 때문에 반응 후 수세가 좀 지나치더라도 염색성에는 큰 영향이 없다. 이에 비해, 단클론항체는 친화성이 균일하기 때문의 만일 친화성이 낮을 경우 수세가 지나치면 항원결정기로부터 항체 해리가 발생할 수 있어 염색성 소실이 일어나기 쉽다. 따라서 단클론항체를 사용할 때는 가능한 친화성이 높은 것을 선택하는 것이 좋다. 동시에 앞에서 지적하였듯이 수세 과정에서 높은 염 농도, 높은 온도 및 낮은 pH와 같은 항원-항체 결합을 약화하는 요인을 피한다. 도한 항체의 친화성은 불용성 면역복합체 형성 능력과 관련되어 있다. 일반적으로 항체의 친화성이 높을수록 침전물을 형성하려는 경향이 높아진다. 침전은 용해성 항원과 항체가 복합체를 형성한 후 느리게 응집체를 만든 다음 마침내 침전물을 만들면서 이루어진다. 미침전 항체는 대부분 낮은 친화성을 가지며 침전이 발생할 때 필요한 격자 형성을 할 수 없다. 이에 비해 단클론항체는 친화성이 높고 낮음에 관계없이 항원과 격자를 형성할 수 있기 때문에 불용성 침전물을 거의 만들지 못한다. 그러나 면역조직화학에서는 일차 항체가 면역복합체 침전물을 형성하는 능력은 중요치 않다. 그 이유는 고정된 조직 항원과 항체가 반응하면 침전보다 오히려 조직 이에서 항체가 꼼짝 못 하도록 하기 때문이다. 교차반응이란 항체와 두 종류 이상의 항원 사이 또는 그 반대로 항원이 몇 개의 다른 항체들과 반응할 때 발생할 수 있는 면역세포 화학적 활성을 의미한다. 면역조직화학에서 최적의 항체 역가는 특별한 검사 조건에서 배경 염색이 가장 적으면서 최대의 특이적인 염색 결과를 얻을 수 있는 항혈청의 가장 높은 희석도를 말한다. 최고 희석도는 기본적으로 존재하는 특이항체를 절대량으로 결정한다. 제조회사들은 일반적으로 바로 사용할 수 있도록 미리 희석한 시약으로 공급하거나 염색 방법, 반응시간, 반응 온도와 같은 변수들에 적합하도록 희석 범위를 추천하고 있다. 그러나 만일 이 정보를 가지고 있지 닪다면 적정에 의해 사용할 면역 시약의 최적 사용 희석률을 결정해야 한다. 희석도가 정확하고 일관되게 준비되었다면 염색의 질을 높이게 될 것이다. 최적의 희석률은 먼저 정해진 반응시간에서 소량의 시약을 일련의 실험 희석률을 만들어 봄으로써 결정할 수 있다. 검체의 크기에 따라 일반적으로 한 장의 절편 당 0.1~0.4ml 정도를 사용하면 적당하다. 일차 항체의 최적 희석률은 염색 강도가 가장 높으면서 동시에 최소 배경의 신호를 나타내는 희석률을 말하며, 이를 최대신호 대 잡음 비율이라 부른다. 일단 최적 사용 희석률이 결정되면 필요와 안정성에 따라 좀 더 많이 준비할 수 있다. 단클론항체를 희석할 때는 다른 기준도 고려해야 한다. 단클론항체는 좀 더 제한적인 등전점과 분자배열로 인하여 희석 완충액의 pg와 이온에 더 민감하다. 따라서 단클론항체의 평가에는 NaCl이 없는 상태로 pH 6.0과 8.6 하에서 적정하도록 제안하고 있다.